引物的設(shè)計原則
關(guān)于引物的設(shè)計原則這個很多人還不知道，今天菲菲來為大家解答以上的問題，現(xiàn)在讓我們一起來看看吧！
1、引物設(shè)計原則長度：15—30bp，其有效長度[Ln=2(G十C)十(A十T)]一般不大于38，否則PCR的最適延伸溫度會超過Taq酶的最佳作用溫度(74度)，從而降低產(chǎn)物的特異性。
2、2、G十C含量：應(yīng)在40%一60%之間，PCR擴增中的復(fù)性溫度一般是較低Tm值引物的Tm值減去5—10度。
3、引物長度小于20時，其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。
4、3、堿基分布的隨機性：應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)4個以上的單一堿基。
5、尤其是不應(yīng)在其3’端出現(xiàn)超過3個的連續(xù)G或C，否則會使引物在G十C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。
6、4、引物自身：不能含有自身互補序列，否則會形成發(fā)夾樣二級結(jié)構(gòu)。
7、5、引物之間：兩個引物之間不應(yīng)有多于4個的互補或同源堿基，不然會形成引物二聚體，尤應(yīng)避免3’端的互補重疊。
8、6、上下游引物的互補性：一個引物的3‘末端序列不允許結(jié)合到另一個引物的任何位點上。
9、7、3’末端：如果可能的話，每個引物的3‘末端堿基應(yīng)為G或C。
10、8、引物應(yīng)當(dāng)超出限制性內(nèi)切酶識別位點至少3個核苷酸。
11、擴展資料引物合成是將預(yù)先連接在固相載體上的活性基團(tuán)被保護(hù)的核苷酸與三氯乙酸反應(yīng)，脫去其5′-羥基的保護(hù)基團(tuán)DMT，獲得游離的5′-羥基。
12、2、合成DNA的原料，亞磷酰胺保護(hù)核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3′端被活化，5′-羥基仍然被DMT保護(hù)，與溶液中游離的5′-羥基發(fā)生縮合反應(yīng)。
13、3、帶帽(capping)反應(yīng)，縮合反應(yīng)中可能有極少數(shù)5′-羥基沒有參加反應(yīng)(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)，這種短片段可以在后續(xù)環(huán)節(jié)根據(jù)實驗需要來選擇純化方式分離掉。
14、4、在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯。
15、參考資料來源：百度百科—引物設(shè)計。
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